一、时间空洞
DNA Pull down 推行是用脱硫生物素标识特异性DNA探针，脱硫生物素探针不错和偶联在磁珠上的链霉亲和素亲和蚁合。提真金不怕火物与磁珠-DNA探针孵育，作用卵白质分子不错和DNA探针特异性蚁合;经过洗涤不错将非特异性蚁合卵白质去除;用Western Blot或质谱对居品进行检测分析。
二、推行观念
DNA pull-down 以感酷好酷好的DNA序列为探针，寻找与该序列蚁合的卵白质，最常见
的利用是寻找某特定基因运转子区域的转录因子。
三、推行历程
（一）探针准备
1、PCR扩增观念片断
表2 PCR响应条目
温度（℃）时分（s）轮回数9810315557210
表3 PCR响应体系
试剂使用量(μl)终浓度PrimeSTAR Max Premix（2X）25 μl1XPrimer F1μl0.2 μMPrimer R1μl0.2 μMTemplate10ng灭菌水Up to 50 μl
全长基因片断的获取，纯化、回收(DNA回收试剂盒，天根：DP214-02 ) ，以全长片断为模板用sense-F/sense-R和AntiSense-F/AntiSense-R引物PCR扩增获
取正义链和反义链的观念基因，跑1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，90V，30min。
2、胶回收
a. 柱均衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放中计络管中）加入500µl均衡液BL，
12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回集会管中。
b. 将单一的观念DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净EP管中，称取分量。
c. 向胶块中加入等体积的溶液PC，50℃水浴扬弃10min控制，使胶块充分 溶化。
d. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放中计络管中。
e. 向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放中计络管中。
f. 叠加操作标准
g. 将吸附柱CB2放中计络管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱置于室温，扬弃3min。8、将吸附柱CB2放入一个新的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30μl洗脱缓冲液EB，室温扬弃2min，12,000rpm离心1min，ag竞咪百家乐集会DNA溶液。
（二）DNA Pull down 推行
1、样本前解决
a. 集会10^7个细胞至 1.5 mL EP 管内，并用预冷 1×PBS洗涤两次；
b. 用100ul 1×PLB重悬细胞；（事前加入卵白酶扼制剂）
c. 30%功率超声10次，超2秒，停3秒，时长2min;
d. 4℃翻转孵育30min裂解细胞；
e. 4℃，16000g离心10min；取上清；
2、链霉素亲和磁珠与生物素标识的DNA蚁合
f. 从4℃雪柜取出链霉亲和素磁珠，颠簸混匀后分裂取50ul到Probe组及Bead组EP管中；
g. 置于磁力架上静置2min，带磁珠十足吸附到管壁后，移除上清液；
h. 用500ul 2×B&W Buffer 重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠十足吸附到管壁后，移除上清液；
i. 叠加h标准一次；
j. 加入50ul2×B&W Buffer 重悬磁珠，并加入等体积生物素标识DNA 探针（50pmol）;
k. 室温翻转孵育20min;
l. 置于磁力架上静置2min，带磁珠十足吸附到管壁后，移除上清液；
m. 用100ul预冷的TE buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠十足吸附到管壁后，移除上清液；
n. 叠加m标准2次（共洗涤3次）；
o. 用100ul预冷的BS/THES buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠十足吸附到管壁后，移除上清液；
p. 叠加o标准1次
q. 用180ul预冷1×PBS重悬磁珠；
3、DNA-磁珠复合物与卵白蚁合
a. 取10ul e标准得回的卵白液标识为input，并于-20℃冻存；
b. 分裂取20ul e标准得回的卵白液到probe组与Bead组中，并加入2ul卵白酶扼制剂；
c. 4℃翻转孵育30min;
d. 置于磁力架上静置2min，带磁珠十足吸附到管壁后，移除上清液；
e. 用200ul预冷的BS/THES buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠十足吸附到管壁后，移除上清液；
f. 叠加e标准4遍（绸缪洗涤5遍）
g. 加入50ul洗脱液及15ul 5×loadingbuffer,热水煮10min。
Pull down居品可平直用于后续WB考据或质谱检测；
四、时间上风
高特异性
平素适用性
高聪惠度
多维度分析
五、适用限制
1️⃣ DNA Pull down_WB，用于检测方针DNA序列与某样本中的待测卵白是否存在相互作用;
2️⃣ DNA Pull down_MS, 用于筛选方针DNA序列与某样本中的哪些卵白具有相互作用。
六、代表性推行服从
七、客户提供
1细胞样品＞4×107；动物组织＞100mg（黄豆粒大小）；植物组织＞5g
2物种信息及基因信息；如后期进行WB推行需自行提供观念卵白抗体
（注：组织样品需液氮速冻、保存于-80度ag百家乐三路实战，样品使用干冰寄送）