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发布日期：2024-07-22 16:06 点击次数：91
一、期间概括
染色质免疫千里淀（Chromatin Immunoprecipitation，简称CHIP）是一种强有劲的分子生物学期间，是检测转录因子等卵白与DNA之间互相作用的主要推行花式之一。通过该期间，不错深刻揭示基因调控机制，为转录调控汇集的究诘提供要害数据支撑。
二、推行想法
本次推行以HIF1A卵白为究诘对象，行使CHIP期间都集qPCR检测，考证其是否与指标运转子区域联结过甚联结位点，揭示其在转录调控中的要害作用。
三、推行历程
1. 细胞交联
a. 用1ml PBS重悬细胞；
b. 加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；
c. 加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，间隔交联；
d. 4℃，3000g，离心5min；弃上清液；
e. 用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，离心5min，去上清;
f. 重迭e法子一遍（此法子千里淀可冻存于-80℃）；
2. 胞核制备和染色质闹翻
a. 用200ul Membrane Extraction Buffer(使用前加入2ul卵白酶/磷酸酶遏止剂)重悬细胞；冰上静置10min；
b. 4℃，9000g，离心3min；弃上清液;
d. 用200ul MNase Digestion Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重悬细胞核;
d. 加入0.2ul MNase ,奏乐混匀；37℃水浴15min，期间5min混匀一次；
e. 加入20μL MNase Stop Solution；混匀后冰上扬弃5min;
f. 4℃，9000g，离心5min；弃上清液；
g. 用500μL of 1X IP Dilution Buffer（使用前加入5ul卵白酶/磷酸酶遏止剂）重悬千里淀；
h. 冰上超声打断5次，每次2min;（超2s，停4s）
i. 4℃,9000g离心5min;转机上清到新的EP管中
3. 免疫千里淀
a. 取220ul上清手脚input,-20℃冻存备用；
b. 诀别取220ul上清到两个新的EP管中，标志为IP与IgG; IP组加入10ug想法抗体（或10ul阳性抗体）；阴性对照组加入2μL IgG ;
c. 样本管放到翻转仪4℃翻转孵育过夜；
d. 震憾混匀Protein A/G磁珠，诀别加20ul磁珠到IP与IgG组中；
e． 样本管放到翻转仪4℃翻转孵育2h；
f. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；
g. 加入1ml IP Wash Buffer，AG百家乐有规律吗并奏乐混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；
h． 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；
i. 重迭法子g~h 2次，即共洗涤3次；
j. 加入1ml IP Wash Buffer 2，并奏乐混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；
k. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；
4. 洗脱
a. 加入150ul 1X IP Elution Buffer重悬磁珠，65℃震憾孵育30min；（要是无法震憾孵育，则65℃水浴40min;并每10min混匀一次）
b. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，将上清转机到一个新的EP管中；
c. input样本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；
d. 万般本均诀别加入6μL NaCl(5M) 、2μL 卵白酶K(20mg/Ml);
e. 奏乐混匀，65℃孵育1.5h;
f. 每样本加入750μL DNA Binding Buffer，奏乐混匀；
g. 吸500ul样本到DNA Clean-Up Column；室温10,000 × g 离心1 min；
h．弃滤液，把剩余的样本加入到DNA Clean-Up Column；室温10,000 × g 离心1 min；
i. 弃滤液，加入750ul DNA Column Wash Buffer；室温10,000 × g 离心1 min；
j. 弃滤液，把吸附柱从头放回网罗管,室温10,000 × g 离心2min；
k. 将吸附柱转机到一个新的1.5ml EP管中，加入50μL DNA Elution solution 到吸附柱；
l. 室温10,000 × g 离心2min;得回的洗脱液即为CHIP居品。可凯旋用于后续qPCR或测序（提防：进行qPCR检测时需按等体积参预）
5. qPCR检测
a. 将Mix在4℃下融解，温存地荆棘倒置混匀并进行移时离心；
b. 冰上配制下表中的响应液
要素 加入量 终浓度
HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox) 5μL 1×
Forward Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM
Reverse Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM
DNA 2μL
RNase-free Water to 10μL
c. 将响应管进行移时离心，确保通盘响应液在响应孔底部。
d. 聘任三步法设施进行响应：
轮回数 法子 温度 时辰 荧光采集
1 预变性 95℃ 5min No
40 变性 95℃ 10s No
退火 60℃ 30s Yes
上述响应铁心后，从60℃～95℃过程中进行融解弧线分析
四、期间上风
高特异性：聘任高亲和力抗体与优化的免疫千里淀决策，有用裁减配景杂音。
高智谋度：联结SYBR Green荧光检测系统，结束低拷贝DNA序列的精准放大与检测。
强可视化数据：电泳图、qPCR柱状图等效果明晰直不雅，便捷数据阐发与发布。
可拓展性强：CHIP居品可凯旋用于qPCR、测序（CHIP-seq）等多种卑劣应用。
五、适用边界
1️⃣转录因子-DNA联结位点筛查
2️⃣染色质修饰与表不雅遗传究诘
3️⃣基因抒发调控机制究诘
4️⃣药物作用机制探索
六、代表性推行效果
CHIP-qPCR柱状图：直不雅展现HIF1A卵白在指标区域的联结强度。
抗体考证与电泳图：考证抗体特异性与片断化进程，为推行数据添砖加瓦。
注：1、如ChIP铁心后进行检测百家乐AG点杀，input手脚对照；如铁心后进行q-PCR,则需要提供掂量靶基因联结位点的具体序列或指标靶基因的称呼、序列或GeneBank ID。
